分类: 实验技术

基于TRV(Tobacco rattel virus)的VIGs(Virus induced gene silencing)

原文发布日期:2013年8月3日

停更许久,原来这个博客定位本来是想多记录记录生信的学习历程,可PhD第一年大部分时间又都扔到了实验室、温室和田间,既然如此就先写点植物生物技术和植物育种方面的东西。

这篇文章整理自一篇最近发表在Nature Protocol上的Protocl (Senthil-Kumar & Mysore, 2014)。

看名字就知道Natrue Protocol是Nature旗下的杂志,2006年创刊,影响因子在6到9之间飘忽不定,杂志的目标和愿景是为bench researchers提供菜谱类型的Step-by-step的实验技术方案,让使用者能将这些技术迅速的应用到自己的研究。

Abstract

基于Tobacco rattele virus (TRV)的virus-induced gene silencing (VIGS)可以下调植物目标基因的表达,已经广泛的应用于不同的植物物种。TRV是双元的(含有两个基因组),正链的RNA病毒,由TRV1和TRV2两个基因组组成。为了介导转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS),TRV2基因组被改造为能够携带一个目标基因片段,同时可以和TRV1基因组一起通过农杆菌转入植物。之后,携带TRV1和TRV2的农杆菌株被用来共侵染3周的植物叶片。由三种方法可以用来将农杆菌侵染植物: needleless syringe, the agrodrench method和 pricking with a toothpick。在侵染2-3周后,目标基因的沉默可以在新长出来的未被侵染的植物叶片中被观察到。这个TRV-VIGS的实验方案只需要4周,比目前其他的植物基因沉默技术都要简单和快速。尽管这个方案是以本式烟草为例,但是也可以用于其他植物。

Introduction:
  1. Targeting induced local lesions in genomes (TILLING) 只能用于已经完成测序且注释很好的植物中应用。
  2. 利用RNA干涉和基因过表达的研究目前仅限于少数植物物种,并且这些研究很费时。
  3. 人工microRNA-mediated的基因沉默和microRNA-induced基因沉默可以在植物中用于目标基因的沉默,但是他们仍需要稳定的植物转化系统,所以同样耗时且无法用于高通量的研究。同样,zinc-finger nuclease (ZFNs), transcription acivator-like effector nuclease (TALENs)和 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9系统可以用于植物特定基因的翘楚,但是他么不主要是适用于”反向遗传学”的工具,而且他们同样需要费时的植物转化。
用VIGs进行目标基因沉默

VIGs是一种转录后沉默(PTGS)的方法,被植物用来当成防卫机制抵抗病毒入侵。当病毒复制时,双链RAN (dsRNA)由依赖RNA的RNA聚合酶切割产生,并触发转录后沉默(PTGS)。这个过程中一个重要步骤是由Dicer-like酶介导的dsRNA切割,从而产生siRNA。切割产生的siRNA结合并激活RNA诱导的沉默复合体(RISC),它可以依赖同源性的方式切割病毒的RNA。根据植物的防御策略,用来沉默植物内源基因的方法被开发出来: 通过克隆目标序列的一个片段,并放入修饰过得病毒载体然后转入植物中。插入病毒载体的目标基因片段在植物细胞里通过病毒的复制机制复制,然后转录本被系统的散布在植物里。当转录后沉默(PTGS)被诱导后,目标基因的siRNA同源体将会产生,直接沉默植物的内源基因。

VIGs首先被报道于90年代晚期(2,3),VIGS的优点在于不仅能用来研究一些比如胚胎致死表型 (无法通过突变体完成),还很适合进行高通量的基因功能研究。他能同时用在基于正向和反向遗传学的基因识别和功能研究。

用TRV作为VIGS载体

Screen+Shot+2014-08-03+a

在烟草中TRV-VIGS的三种方法:
  1. Agrobacterium inoculatation by needleless syringe
  2. Agrodrench
  3. Pricking the leaves with a toothpick

Screen+Shot+2014-08-03+a-1

VIGS的局限性
  1. 大多数情况下,VIGS不能完全沉默基因的表达。
  2. 目标外基因可能会被沉默。这需要通过选择合适的片段避免。
  3. TRV可能不光改变植物的基因表达,还可能会导致轻微的病毒侵染相关表型。
  4. 基因沉默效率有时候并不统一,这时候需要增加重复以得到一致的结果。
Reference

1. Senthil-Kumar M, Mysore KS (2014) Tobacco rattle virus–based virus-induced gene silencing in Nicotiana benthamiana. Nature Protocols.

2. Ruiz MT, Voinnet O, Baulcombe DC (1998) Initiation and Maintenance of Virus-Induced Gene Silencing. THE PLANT CELL ONLINE 10: 937–946.

3. Kumagai MH, Donson J, della-Cioppa G, Harvey D, Hanley K, et al. (1995) Cytoplasmic inhibition of carotenoid biosynthesis with virus-derived RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences 92: 1679–1683. doi:10.1073/pnas.92.5.1679.